植物RNA提取试剂盒(适用含高多糖多酚植物组织) R1050
货号 |
产品名称 |
规格 |
价格 |
R1050-50 |
植物RNA提取试剂盒(适用含高多糖多酚植物组织) |
50次 |
550元 |
R1050-100 |
植物RNA提取试剂盒(适用含高多糖多酚植物组织) |
100次 |
900元 |
描述::一些植物组织富含多糖、多酚、次级代谢产物,在细胞裂解后可与RNA紧密结合形成难溶的胶冻状沉淀导致提取失败,明显抑制下游RNA反应如逆转录和PCR等。Plant RNA Extraction Kit组合提供了卓越的植物RNA分离方案。首先,Lysis Solution采用复合型强变性剂和裂解剂能够裂解坚硬的植物组织,并完全抑制RNA酶活性;同时,Lysis Solution独特的内在成分既能抑制多酚氧化,又能最大限度地结合植物多糖和多酚以及次生代谢产物。其次,强烈的有机抽提步骤可进一步灭活RNA酶,去除蛋白质和基因组DNA污染,并进一步去除植物多糖和多酚以及次生代谢产物。随后,任何残留的多糖和多酚可进一步被Plant RNA Aid结合,并通过离心去除。RNA提取可在60分钟内完成,所提取的RNA纯度极高,完全不含DNA和多糖污染,可用于构建cDNA文库、RT-PCR、Northern转印分析、Poly(A) mRNA纯化、体外翻译、和RNA酶保护实验。由于动物肝脏和肌肉等组织富含糖原,此植物RNA提取试剂盒也特别适用从动物肝脏或肌肉组织提取高纯度的总RNA。
规格:50次 100次
储存: 4 oC避光保存 1年有效
操作步骤:
1. 植物组织细胞破碎裂解
冰上操作。立即并快速破碎组织至关重要。初始组织细胞过量不仅使RNA得率下降,还将导致DNA和蛋白质污染。
1.1植物组织破碎与裂解
确定组织用量:推荐按比例每50~150 mg新鲜植物组织加0.5 ml Lysis Solution,但植物组织用量的上限变化甚大。(1)某些新鲜植物组织含水量甚高,而较干燥的植物组织50mg可能已经接近上限。为获足量RNA必须测试加入每种组织的量。注意使用过量的组织将导致提取失败。(2) 软组织、叶片、花、多汁组织、发芽种子等可直接加入Lysis Solution研磨破碎,而坚硬的植物组织如种子、木质茎干等最好先在液氮中研磨破碎为粉末。
按比例每50-150 mg植物组织加0.5 ml Lysis Solution,按下列方法之一裂解组织。(1) 研钵:适用于液氮冻存组织。将液氮冻存组织研成粉末,加0.5 ml Lysis Solution,继续研磨组织至完全破碎也可转移到玻璃匀浆器继续研磨。(2) 玻璃匀浆器:放入剪碎的新鲜植物组织,加入0.5 ml Lysis Solution,放置冰上,上下手动匀浆组织10-20次。(3) 内切式高速机械匀浆器:将植物组织放入塑料或玻璃试管内,试管置冰浴烧杯中,加入0.5 ml Lysis Solution,将内切式分散器头插入管内溶液中间并与组织块接触,转速12,000-20,000 rpm,缓慢上下移动试管10-20次,直到大部分组织打散。注意:少量难以打碎的组织碎片不影响后续RNA提取。用研钵和玻璃匀浆器匀浆组织时应略微多加一些裂解液,以补充裂解产物粘在器皿壁上造成的体积丢失。破碎组织用玻璃匀浆器可能比液氮研磨方便。
1.2植物培养细胞的破碎与裂解
弃培养基,收集细胞。每1-5 ´ 106个细胞加0.5 ml Lysis Solution,须有效地覆盖瓶皿的细胞表面。晃动或用吸头吹打使提取液流过并裂解所有细胞。置冰上10分钟,倾斜瓶皿使粘稠的裂解物聚于一处以便取出。
2 将裂解产物转移到1.5 ml离心管,置冰上20-30分钟。注意:富含多糖 和多酚的植物组织可延长孵育时间至30-60分钟。
3 12,000 ´ g 4 oC 离心10分钟。取上清液转移到新管。注意:组织纤维碎片、植物多糖和多酚等沉淀在管底。大部分基因组DNA也在管底形成疏松粘稠的团状物。取上清液时如吸入少量拉丝状DNA粘稠物,不影响后续实验。
4 加入0.5 ml Extraction Reagent,充分颠倒混匀,冰上孵育10分钟。
5 离心12,000 ´ g 4 oC 10分钟,溶液分为两相。RNA在上层水相,下层为有机相,两相界面是一层薄膜,其厚度与组织细胞类型和多少有关。小心吸出水相转移到新离心管。注意:取上清液时应保留0.5-1 mm厚的水相,以免扰动和吸入下面的碎片和有机相。如果吸入,应将所取的上清液放回管中并重新离心10分钟,再次吸取水相。这一点至关重要,违背此原则容易导致RNA降解和DNA污染。
6 优化步骤:对多糖含量特别丰富的植物,加入上清液1/10体积(50~70ml)的Plant RNA Aid (如有沉淀,用前轻摇重悬)到上清液,混匀,冰上孵育20分钟以进一步结合植物多糖和多酚,溶液将会变浑浊。离心12,000 ´ g 4 oC 10分钟。小心吸出上层水相转移到新离心管,勿扰动和吸入下面的透明胶冻状沉淀。注意:完全去除植物多糖至关重要,否则将明显降低RNA回收率,并使沉淀呈难溶解的胶冻状。
7 将步骤5或6获得的上清液约500 ml转移到新管,加入0.7~1体积的异丙醇混匀。冰育5-10分钟已足以沉淀RNA。用更低的温度和更长的时间进行沉淀仅在组织极少时有用。
8 10,000´g 4 oC 离心10分钟。管底可见少许RNA沉淀。注意:如初始组织细胞量少,RNA将附着在管壁,用肉眼几乎难辨沉淀,但不影响实验。如RNA 沉淀量很多并呈胶冻状,通常表明有多糖、多酚和蛋白污染。应仔细检查操作步骤。一个补救措施是用Lysis Solution溶解沉淀,从步骤1开始重新抽提沉淀。
9 弃上清。立即加入1 ml 75%乙醇,颠倒混匀数次洗涤沉淀。12,000 ´ g离心5分钟。弃上清,尽量完全吸去管壁上的液体。注意:乙醇洗涤后RNA沉淀容易漂浮,勿倒掉或吸走RNA沉淀。RNA沉淀在75%乙醇中可在4 oC保存一周或在-20 oC保存一年。
敞开管口空气干燥5-10分钟使残留液体挥发,RNA略微沉淀干燥即可。用50-100 ml自备的DEPC处理的高压消毒纯水溶解沉淀。RNA溶液可保存于-70 oC或液氮中。注意:过分干燥将使RNA难以溶解。55 oC加热或反复冻融数次可以助溶。RNA溶液加3倍体积乙醇冻存于-20 oC,用时离心沉淀。
蛋白研究:蛋白提取、蛋白定量、Western Blot…核酸研究:核酸提取、PCR、核酸电泳… 抗体:单克隆抗体、多克隆抗体、酶标抗体… 细胞生物学:转染试剂、生化测定、细胞培养…
联系方式
通信地址:北京市昌平区振兴路36号2号楼3层330
客服电话:010-60781808 010-62027915
公司邮箱:sale@applygen.com
邮政编码:102299
版权所有 北京普利莱基因技术有限公司 Applygen Technologies Inc.
京ICP备05011537号-1