液体样本含硒谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒 E2002
货号 |
产品名称 |
规格 |
价格(元) |
E2002 |
液体样本含硒谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒 |
100次 |
670 |
描述:液体样本含硒谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒是一种简易的利用紫外比色法检测谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性的试剂盒。GPx包括含硒和不含硒的两类,绝大部分细胞内的GPx是含硒的。本试剂盒检测的是最常见的含硒的GPx。GPx可以清除活细胞内的过氧化物,在保护细胞免受自由基损伤中发挥重要作用。细胞内的脂质易与自由基发生反应,生成脂质过氧化物。GPx可以利用还原型谷胱甘肽(GSH)还原脂质过氧化物,从而消除自由基的毒害作用。GPx在各种组织中都有分布,在一些病理状况下谷胱甘肽过氧化物酶的活力会发生明显上调或下调。本试剂盒检测GPx线性范围为31-1000mU/ml,灵敏度≤31mU/ml。
规格:100次
储存:按说明书要求储存,12个月有效
操作步骤:
1. 样品的准备
血浆样品或红细胞裂解液的准备:取新鲜抗凝血至少0.5ml,4℃,1000g离心5分钟,上清为血浆。对于沉淀中红细胞,利用冰冷PBS洗涤3次。取约5倍红细胞体积的冰冷的纯水,重悬细胞沉淀,冰浴10分钟。4℃,10000g离心10分钟。取上清进行蛋白浓度定量后用于谷胱甘肽过氧化物酶的测定。不立即测定的样品可以-70℃保存。如果样品中谷胱甘肽过氧化物酶活性超出测定范围,可利用样品稀释液适当稀释后测定,稀释倍数请通过预实验确定。
2. 试剂盒的准备
2.1 GSH储备液的配制:在本试剂盒提供的12 mg GSH中加入1ml的纯水,溶解并混匀,即为GSH储备液,浓度为40 mM。
2.2NADPH储备液的配制:在本试剂盒提供的15mg NADPH中加入0.9ml纯水,溶解并混匀,即为NADPH储备液,浓度为20 mM。
2.3谷胱甘肽过氧化物酶检测工作液的配制:根据待测样品数配制适当量的谷胱甘肽过氧化物酶检测工作液,表中试剂按比例混合后即为谷胱甘肽过氧化物酶检测工作液。
2.4过氧化物工作液的配制:取20 μl过氧化物试剂(t-Bu-OOH)加入5ml纯水中,混匀,然后根据需要取部分t-Bu-OOH水溶液,利用谷胱甘肽过氧化物酶检测缓冲液稀释10倍,即为过氧化物工作液。
注:稀释过的过氧化物水溶液或过氧化物工作液可冰浴保存请勿超过6 h。
3. 标准品的准备
将20mM的NADPH储备液用谷胱甘肽过氧化物酶检测缓冲液稀释成500、250、125、62.5、31.2、15.6 μM浓度的NADPH溶液,用于标准曲线测定。在本试剂盒相同反应体系下NADPH标准曲线只需要测定1次。
4. 测定方法
4.1 NADPH标准曲线测定:利用上述系列浓度NADPH标准品,各取200μl到96孔板中,各孔加入NADPH量分别为100、50、25、12.5、6.2、3.1 nM,测定A340nm。
4.2 使用96孔板,依次加入谷胱甘肽还原酶检测工作液、样品后,混匀,25℃或室温孵育2分钟。
4.3 各孔加入过氧化物工作液50μl,25℃孵育20分钟。
4.4 各孔加入过氧化物工作液50μl启动谷胱甘肽过氧化物酶反应后,立即开始计时,并在2.5、5、10、20分钟等时间点测定A340nm。如果样品吸光度下降过快,可适度稀释样品后测定;如果样品吸光度下降过慢,可适当延长反应时间进行样品测定。
5. 数据处理
利用NADPH标准品的量为横坐标,吸光度值为纵坐标制作标准曲线,并获得横纵坐标之间
的函数关系式,然后利用各样品的吸光度值计算样品中剩余的NADPH量,从而换算为谷胱甘肽过氧化物酶活力。对于细胞和组织样品,可以根据样品中蛋白浓度测定,计算每毫克蛋白中谷胱甘肽过氧化物酶活力。由于有多个时间点的测定,可以选择时间线性良好的时间段计算谷胱甘肽过氧化物酶活力。
谷胱甘肽过氧化物酶酶活性定义:在25℃,pH 7.2条件下,每分钟将1.0μmol的还原型谷胱甘肽氧化为氧化型谷胱甘肽的谷胱甘肽过氧化物酶为1 U,1 U=1000 mU。
计算公式:酶活力(mU)=NADPH生成量(nmol)*2/反应时间(min)。
蛋白研究:蛋白提取、蛋白定量、Western Blot…核酸研究:核酸提取、PCR、核酸电泳… 抗体:单克隆抗体、多克隆抗体、酶标抗体… 细胞生物学:转染试剂、生化测定、细胞培养…
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