组织细胞丙氨酸氨基转移酶(谷丙转氨酶)ALT/GPT活性检测试剂盒(赖氏法) E2022
货号 | 产品名称 | 规格 | 价格 |
E2022 | 组织细胞丙氨酸氨基转移酶(谷丙转氨酶)ALT/GPT活性检测试剂盒(赖氏法) | 105次 | 450元 |
描述:丙氨酸氨基转移酶又称谷丙转氨酶、谷氨酸转氨酶、丙氨酸氨基转换酶,英文名:Alanine aminotransferase(简称ALT)或Glutamate pyruvate transaminase(简称GPT)。主要存在于肝细胞浆内,正常情况下,细胞内浓度高于血清中1000-3000倍。只要有1%的肝细胞被破坏,就可以使血清酶增高一倍。谷丙转氨酶(ALT)被世界卫生组织推荐为肝功能损害最敏感的检测指标。谷丙转氨酶还存在于心脏和骨骼肌中。本试剂盒可以检测实体组织、培养细胞等生物样品中的ALT活性。
原理: 试剂盒采用赖氏法进行ALT活性检测。丙氨酸氨基转移酶(ALT/GPT)能催化丙氨酸与酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸,后者在酸性条件下与显色剂(2,4-二硝基苯肼)作用生成丙酮酸二硝基苯腙,其在碱性条件下呈棕红色,颜色深浅可以反映酶活性高低。
适应范围: 本试剂盒可以检测组织或培养细胞中的丙氨酸氨基转移酶的活性。
组成: (105次)
组分 |
规格 |
保存条件 |
组织细胞裂解液 |
100ml |
4℃保存 |
丙酮酸标准品 |
0.6ml |
-20℃避光保存 |
底物缓冲液 |
6ml |
4℃避光保存 |
PB缓冲液 |
0.6ml |
4℃保存 |
显色剂:2,4-二硝基苯肼溶液 |
6ml |
4℃避光保存 |
终止试剂 |
60ml |
常温保存 |
储存:以上组分按要求保存,6个月有效。
操作步骤:
一. 样品准备:
1、动物用生理盐水(0.9% NaCl,含有0.16mg/ml肝素钠) 灌流清除血液后获取组织样品。按照100mg组织加入500ul-1000ul,4 ℃或冰浴预冷组织细胞裂解液,使用玻璃匀浆器或电动匀浆器等4 ℃或冰浴匀浆。随后4 ℃ 12000rpm离心5min,取上清,部分进行蛋白定量(普利莱BCA法蛋白定量试剂盒P1511)。
2、收集细胞,按照每107个细胞加入500ul-1000ul,4 ℃或冰浴预冷组织细胞裂解液,使用玻璃匀浆器或电动匀浆器等4 ℃或冰浴匀浆。随后4 ℃ 12000rpm离心5min,取上清,部分进行蛋白定量(普利莱BCA法蛋白定量试剂盒P1511)。
二.酶活力测定:
1. 丙酮酸标准品工作液的配制:按下表用底物缓冲液和PB缓冲液将丙酮酸标准品稀释成0、1.1ug、2.2ug、3.3ug、4.4ug、5.5ug七个浓度,充分混匀。丙酮酸0浓度孔只加底物缓冲液和PB缓冲液,以此作为空白孔调零,按照下述操作步骤操作,而后在520nm处读吸光度OD值,绘制标准曲线。
使用分光光度计测定,丙酮酸标准品工作液稀释比例:
PB缓冲液(ul) |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
底物缓冲液(ul) |
50 |
45 |
40 |
35 |
30 |
25 |
丙酮酸标准品(ul) |
0 |
5 |
10 |
15 |
20 |
25 |
对应丙酮酸微克数 |
0 |
1.1 |
2.2 |
3.3 |
4.4 |
5.5 |
使用酶标仪测定,丙酮酸标准品工作液稀释比例:
PB缓冲液(ul) |
4 |
4 |
4 |
4 |
4 |
4 |
底物缓冲液(ul) |
20 |
18 |
16 |
14 |
12 |
10 |
丙酮酸标准品(ul) |
0 |
2 |
4 |
6 |
8 |
10 |
对应丙酮酸微克数 |
0 |
0.44 |
0.88 |
1.32 |
1.76 |
2.2 |
2. ALT活性测定:
参照下表使用分光光度计进行操作。
|
丙酮酸标准品工作液 |
样本管 |
样本对照管 |
空白管 |
样本(ul) |
-- |
10 |
10 |
-- |
标准品工作液(ul) |
60 |
-- |
-- |
-- |
蒸馏水(ul) |
-- |
-- |
-- |
10 |
底物缓冲液(ul) |
-- |
50 |
--- |
-- |
充分混匀,37℃,孵育30分钟 |
||||
显色剂;2,4-二硝基苯肼溶液(ul) |
50 |
50 |
50 |
50 |
充分混匀,37℃,孵育20分钟 |
||||
底物缓冲液(ul) |
-- |
-- |
50 |
50 |
终止试剂(ul) |
500 |
500 |
500 |
500 |
充分混匀,室温静置10分钟,于波长520nm使用分光光度计测定各标准品和样本管吸光度值,注意设置样品空白管。
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使用酶标仪测定反应体系:
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丙酮酸标准品工作液 |
样本管 |
样本对照管 |
空白管 |
样本(ul) |
-- |
4 |
4 |
-- |
标准品工作液(ul) |
24 |
-- |
-- |
-- |
蒸馏水(ul) |
-- |
-- |
-- |
4 |
底物缓冲液(ul) |
-- |
20 |
--- |
-- |
充分混匀,37℃,孵育30分钟 |
||||
显色剂;2,4-二硝基苯肼溶液(ul) |
20 |
20 |
20 |
20 |
充分混匀,37℃,孵育20分钟 |
||||
底物缓冲液(ul) |
-- |
-- |
20 |
20 |
终止试剂(ul) |
200 |
200 |
200 |
200 |
充分混匀,室温静置10分钟,于波长520nm酶标仪测定各标准品和样本管吸光度值,注意设置样品空白管。
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三、ALT酶活力计算:
以丙酮酸微克数为x轴,测得的吸光度OD值为y轴,绘制标准曲线,根据标准曲线计算样本对应的丙酮酸质量,然后根据ALT酶活力单位计算公式,计算ALT酶活性,建议以蛋白浓度进行校正。
分光光度计测定,ALT酶活力:
未稀释样本ALT酶活力 =(样本管丙酮酸微克数-样本对照管丙酮酸微克数)×250/2.5
稀释样本ALT酶活力=(样本管丙酮酸微克数-样本对照管丙酮酸微克数)×稀释倍数×250/2.5
分光光度计测定时,ALT酶活力:
未稀释样本ALT酶活力 =(样本管丙酮酸微克数-样本对照管丙酮酸微克数)×100/2.5
稀释样本ALT酶活力=(样本管丙酮酸微克数-样本对照管丙酮酸微克数)×稀释倍数×100/2.5
ALT酶活力单位定义:每毫升样本在37℃与底物作用30min后,能产生2.5ug的丙酮酸为一个丙氨酸氨基转移酶活力单位。
说明:
1、谷丙转氨酶的正常参考值为0~40U。高于40U即称为谷丙转氨酶升高
2、标准曲线上数值在20~100U是准确可靠的,超过200 U 时,需将样品稀释。
3、溶血标本不宜使用,因血细胞内转氨酶活力较高,会影响测定结果。
蛋白研究:蛋白提取、蛋白定量、Western Blot…核酸研究:核酸提取、PCR、核酸电泳… 抗体:单克隆抗体、多克隆抗体、酶标抗体… 细胞生物学:转染试剂、生化测定、细胞培养…
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