Annexin V-Alexa Fluor 647/PI 细胞凋亡检测试剂盒 C0020-20
货号 | 产品名称 | 规格 | 目录价(元) |
C0020-20 | Annexin V-Alexa Fluor 647/PI 细胞凋亡检测试剂盒 | 20次 | 820元 |
描述:
Annexin V-Alexa Fluor 647/PI细胞凋亡检测试剂盒(Annexin V-Alexa Fluor 647/PI Apoptosis Detection Kit)是用Alexa Fluor 647标记了的Annexin V作为探针,来检测细胞早期凋亡的发生,可用流式细胞仪或其他荧光检测设备进行检测。
其检测原理为:在正常的活细胞中,磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine,PS)位于细胞膜的内侧,但在早期凋亡的细胞中,PS从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。Annexin-Ⅴ(膜联蛋白-V)是一种分子量为35-36 kDa的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力结合。可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的细胞膜结合。
另外,本试剂盒中还提供了碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)用来区分存活的早期细胞和坏死或晚期凋亡细胞。PI是一种核酸染料,它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整细胞膜,但可以透过凋亡晚期和坏死细胞的细胞膜而使细胞核染红。因此,将Annexin V与PI联合使用时,PI则被排除在活细胞(Annexin V-/PI-)和早期凋亡细胞(Annexin V+/PI-)之外,而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被Alexa Fluor 647和PI结合染色呈现双阳性(Annexin V+/PI+)。
本试剂盒需要使用流式细胞仪进行检测。
使用方法:
1.1 样品染色
1. a) 悬浮细胞:300g,4 ℃离心5 min收集细胞。
b) 贴壁细胞:用不含EDTA的胰酶消化后,300g,4 ℃离心5 min收集细胞。胰酶消化时间不宜过长,以防引起假阳性。
2. 用预冷的PBS洗涤细胞2次,每次均需300g,4 ℃离心5 min。
3. 加入250 μL 1×Binding Buffer重悬细胞,调节其浓度为1×106/mL。
4. 取100μL细胞悬液于5mL流式管中,加入5μL Annexin V-Alexa Fluor 647和10μL PI,轻轻混匀。
5. 避光、室温反应15 min。
6. 加入400μL PBS,混匀,样品在1小时内用流式细胞仪检测。
注意:为了避免洗涤细胞时损失细胞,在吸液时可以用大的Tip头套上小的Tip头吸液。
1.2 样品分析
Annexin V-Alexa Fluor 647最大激发波长为651nm,最大发射波长为667nm;PI-DNA复合物的最大激发波长为535nm,最大发射波长为615nm。用CellQuest等软件进行分析,绘制双色散点图(two-color dot plot),Alexa Fluor 647为横坐标,PI为纵坐标。每个样采集10,000 even
注意事项:
1)由于细胞凋亡是一个快速的过程,建议样品在染色后1小时之内进行分析。
2)对于贴壁细胞,消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞,需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。处理贴壁细胞时要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。胰酶消化时间过短,细胞需要用力吹打才能脱落,容易造成细胞膜的损伤,PI摄入过多;消化时间过长,细胞膜同样易造成损伤,甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-Alexa Fluor 647的结合。消化时将胰酶铺满孔板底后,轻摇时胰酶与细胞充分接触,然后倒掉大部分胰酶,利用剩余的少量胰酶再消化一段时间,待细胞间空隙增大,瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中尽量不用EDTA,EDTA会影响Annexin V与PS的结合。
3)如果样品来源于血液,请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS,能与Annexin V结合,从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并在200 g离心洗去血小板。
4)试剂在开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。
5)Annexin V-Alexa Fluor 647和PI是光敏物质,在操作时请注意避光。
蛋白研究:蛋白提取、蛋白定量、Western Blot…核酸研究:核酸提取、PCR、核酸电泳… 抗体:单克隆抗体、多克隆抗体、酶标抗体… 细胞生物学:转染试剂、生化测定、细胞培养…
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