碱性磷酸酶酶活性检测试剂盒 E1040
货号 | 产品名称 | 规格 | 价格(元) |
E1040 | 碱性磷酸酶酶活性检测试剂盒 | 100次 | 380 |
描述:碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP),也称碱性磷酸酯酶,是动物和微生物生理过程中一种非常重要的酶,在碱性环境中可以水解各种天然及人工合成的磷酸单酯化合物底物。ALP与人类疾病如高磷酸酯酶血病、一些骨骼和肝脏疾病的发生有关,被用作很多疾病的辅助诊断依据;检测碱性磷酸酶的活性对于环境监测、食品质量控制等方面具有重要的作用。
特点:本试剂盒(Alkaline Phosphatase Assay Kit)可以快速、便捷地检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血清、血浆、尿液等样品中内源性的碱性磷酸酶活性。产品包括标准品和空白对照,本试剂盒可进行100个样品的检测。
规格:100次
储存:-20℃保存 12个月有效
操作步骤:
1. 试剂准备:将所有试剂取出,恢复至室温使用。
a. 显色底物溶液:取一管显色底物,溶解于1.3ml的检测缓冲液中,充分溶解和混匀,冰上放置。新鲜配制的显色底物溶液需在6小时内使用。
b. 标准品工作液: 取10μl p-nitrophenol溶液 (10mM), 用检测缓冲液稀释至0.2ml,最终浓度为0.5mM。
2. 样品准备: a. 细胞或组织裂解液的准备:采用适当细胞或组织裂解液裂解细胞和组织,如果有必要需进行适当匀浆,随后离心取上清,用于碱性磷酸酶的检测。注意:裂解液中不能含有磷酸酶抑制剂。样品可以-80℃冻存,但需避免反复冻融。b. 血浆、血清和尿液的准备:血浆和血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定,但为了消除样品本身颜色的干扰,需设置加了血浆或血清但不加底物的对照。血浆制备时不能用含EDTA和柠檬酸盐的抗凝管。尿液通常也可以直接用于测定。样品可以-80℃冻存,但需避免反复冻融。
c. 样品的稀释:(若有较多样本需测定,建议先取适当的样品进行预实验。)如果样品中含有较高活性的碱性磷酸酶,测定的OD值超过标曲范围,可以使用原有的裂解液或PBS等进行稀释,也可以采用试剂盒中的检测缓冲液进行稀释。如果使用试剂盒中提供的检测缓冲液进行稀释,需注意保留足够的检测缓冲液用于试剂盒的检测过程。(大鼠血清:建议稀释10-50倍;小鼠肾脏:建议按每10mg组织加1ml组织裂解液的比例进行碾磨或匀浆,离心取上清后稀释100倍左右再进行测定;小鼠肝脏:建议按每10mg组织加1ml水或组织裂解液的比例进行碾磨或匀浆, 离心取上清后稀释2-4倍再进行测定。)
3. 参考下表使用96孔板设置标准品孔(S1-S6)。
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S1 |
S2 |
S3 |
S4 |
S5 |
S6 |
0.5mM标准品工作液(μl) |
4 |
8 |
16 |
24 |
32 |
45 |
检测缓冲液(μl) |
96 |
92 |
84 |
76 |
68 |
55 |
4. 参考下表使用96孔板设置空白对照孔和样品孔。样品通常可以直接加50μl。如果样品中的碱性磷酸酶活性过高,可以减少样品用量(需使用检测缓冲液补足至每孔50μl)或适当稀释后直接加50μl至样品孔进行测定。
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空白对照孔 |
样品孔 |
检测缓冲液(μl) |
50 |
- |
显色底物液(μl) |
50 |
50 |
样品(μl) |
- |
50 |
5. 用枪头轻轻吹打混匀,也可借助摇床进行混匀。
6. 37℃孵育15-20分钟。(说明:待测样品中碱性磷酸酶活性较低时,可适当延长孵育时间至30分钟)
7. 每孔加入100μl反应终止液终止反应。此时,标准品或有碱性磷酸酶活性的孔会呈现不同深浅的黄色。8. 在405nm测定吸光度,如果不能测定405nm,也可以在400-415nm范围内检测吸光度。如果不能立即测定,可以在2小时内完成测定,所显现的黄色在2小时内稳定。
9. 根据酶活性定义,计算出样品中的碱性磷酸酶活性。
ALP活性(U/L)=样品稀释倍数×A/ T
A=测得的样本OD值经标曲换算出的浓度(μmol/L)
T=反应时间(分钟)
说明:
1. 如果希望进行酶活性的绝对定量,进行酶反应时必须注意精确计时。此时推荐采用孵育30分钟等较长的时间,以减小操作过程中的时间误差;如果样品中酶活性较高,则可以预先适当稀释样品。
2. 待测样品避免反复冻融且避免出现EDTA、氟离子、柠檬酸盐等碱性磷酸酶的抑制剂。
3. 所测样本的值高于标准曲线的上限,应稀释样品后重新测定。
4. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作,检测缓冲液和p-nitrophenol溶液对皮肤有刺激性,请注意适当防护,反应终止液有腐蚀性,请小心操作,若不慎沾到皮肤上请马上用清水冲洗干净。
5. 该试剂盒仅供科学研究使用。
蛋白研究:蛋白提取、蛋白定量、Western Blot…核酸研究:核酸提取、PCR、核酸电泳… 抗体:单克隆抗体、多克隆抗体、酶标抗体… 细胞生物学:转染试剂、生化测定、细胞培养…
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