胶原蛋白酶2,9检测试剂盒(MMPZymographyAssayKit) P1700
货号 | 产品名称 | 规格 | 价格(元) |
P1700 | 胶原蛋白酶2,9检测试剂盒(MMPZymographyAssayKit) | 750次 | 880 |
描述:试剂盒采用酶谱法(zymography)检测MMP-2、MMP-9活性。Zymography是一种广为使用的、基于SDS-PAGE电泳和反相凝胶染色的蛋白酶检测方法,其灵敏度可达1 nM,高于ELISA方法2,其基本原理和程序是:制备加有胶原酶底物的SDS-PAGE凝胶,含蛋白酶的样品在此凝胶中进行电泳,电泳结束后取出凝胶与酶反应Buffer孵育,凝胶染色与脱色。凝胶中由于含底物蛋白而被深染,形成深色背景,但在有蛋白酶条带的位置,蛋白酶降解凝胶中的底物蛋白,因而不被染色而形成透亮区域,从而能同时指示MMP-2、MMP-9的大小位置(酶谱)及活性。本试剂盒提供MMP-2、MMP-9特异蛋白底物及酶学反应缓冲液,可检测少至0.1~0.5 µl血液中的MMP-2、MMP-9酶谱及活性,检测灵敏度约为1 nM。试剂盒可进行50次标准小胶检测,如果小胶加样孔为10~15个,则总计可检测500~750个样品。
规格:750个样
储存: 按说明书要求保存,12个月有效
操作步骤:
1. 制备含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝胶:推荐分离胶浓度为8%。按照标准程序制备SDS-PAGE凝胶。将10 × substrate G 融化,90 ºC加热5分钟,分别在浓缩胶和分离胶中额外加入10 × substrate G 并使之稀释10倍,混匀后加入过硫酸铵和TEMED,等待凝胶聚合。
2. 待测样品1:1稀释于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制:4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue),混合后直接上样。切勿加热变性,并且仅使用不加还原剂的上样缓冲液。可通过预试验确定加样量,使用普通蛋白预染Marker即可。阳性对照(可选步骤):可取人、小鼠、大鼠或兔100µl全血与100µl 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer等体积混合,取5-15µl上样。
3. 低电流恒流电泳,每一块小胶电流为20 mA。溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。
4. 洗涤凝胶:取出凝胶,去除浓缩胶,放入容器内。可先用适量蒸馏水冲洗凝胶,然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸馏水稀释),室温漂洗凝胶2 × 18小时,中间换液。
5. 孵育:倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸馏水稀释),室温或37ºC孵育1~5小时。阳性对照或者血中的MMP通常37ºC孵育1小时即可显示。如MMP活性低,应延长孵育时间为10小时或过夜。
6. 显色:倒掉Buffer B,加入SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液(操作步骤见SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液说明书)。凝胶的大部分区域被深染,在有MMP条带的位置不被染色而形成透亮区域。透明区域的位置和范围指示MMP-2、MMP-9的大小位置(酶谱)及活性。阳性对照将在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出现透明条带。
条带扫描:将凝胶放在扫描仪上扫描。虽然MMP条带透明,但凝胶背景并非真正全黑。解决办法:可用非透射光扫描,或用软件图像处理程序调整背景显示为灰度显示,并尽量设置为黑色。MMP条带则为白色,这种背景黑条带白的格式是英文论文中最常见的格式。
蛋白研究:蛋白提取、蛋白定量、Western Blot…核酸研究:核酸提取、PCR、核酸电泳… 抗体:单克隆抗体、多克隆抗体、酶标抗体… 细胞生物学:转染试剂、生化测定、细胞培养…
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